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前言

錯配修復缺陷（dMMR）指四種錯配修復（MMR）蛋白中至少一種表達缺失，主要由三種原因導致：MMR基因胚系突變、體系突變，以及MLH1基因啟動子區(qū)高度甲基化。林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）又稱遺傳性非息肉病性結直腸癌（HNPCC），是一種常染色體顯性遺傳病，通常由MMR基因胚系突變引起。與MMR基因突變相比，MLH1甲基化導致的MLH1蛋白缺失更為常見。多個指南共同推薦，在結直腸癌（CRC）和子宮內膜癌（EC）中，異常的MLH1免疫組織化學（IHC）結果應進行MMR基因胚系檢測或腫瘤組織MLH1甲基化檢測，甲基化提示散發(fā)性腫瘤^[1-3]。

CRC林奇綜合征篩查流程^[2]

組成性表觀突變

上述篩查流程采用MLH1基因甲基化檢測，將散發(fā)病例排除在MMR基因胚系檢測之外。雖然可以降低篩查成本，提高患者的依從性，但是忽略了組成性MLH1基因表觀突變/甲基化（constitutional MLH1 epimutation/ methylation，也有翻譯成結構性/體質性MLH1表突變）這樣的罕見病例。組成性表觀突變的特征是正常組織中單個等位基因的啟動子甲基化和轉錄失活，外周血淋巴細胞（PBL，中胚層）、正常結腸粘膜（內胚層）、肌肉（中胚層）、口腔粘膜（外胚層）樣本中均可能檢測到^[4]。組成性表觀突變分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性表觀突變沒有明顯的連鎖序列變化，在減數分裂過程中是可逆的，偶爾以非孟德爾模式傳遞給下一代，很少與明確的癌癥家族史相關；繼發(fā)性表觀突變由DNA序列改變的順式作用引起，遵循孟德爾遺傳模式傳遞^[4-7]。組成性表觀突變可能是嵌合性的，甲基化水平在不同等位基因和組織中具有異質性^[4-5]。

MLH1和MSH2基因的組成性表觀突變已被確定為LS的罕見病因。MSH2表觀突變是典型的繼發(fā)性表觀突變，是位于MSH2上游17 kb的EPCAM基因3’端胚系缺失的結果^[6]。組成性MLH1表觀突變的分子機制較為復雜，發(fā)生在2-3%的突變陰性的疑似林奇家系中^[7]。組成性甲基化病例表現為與MLH1-LS一致的早發(fā)性和/或多發(fā)性原發(fā)腫瘤；也會導致腫瘤出現MLH1缺失、MSI-H和MLH1甲基化，這些特征與常見的散發(fā)病例重疊^[8]。

MLH1表觀突變隊列研究^[8]

美國俄亥俄州的一項回顧性研究納入了Columbus（n=1566）和OCCPI（n=3310）兩個CRC隊列，入組標準為（1）MLH1缺失和/或MSI-H，（2）MLH1甲基化，（3）PBL DNA或全血DNA的可用性。使用焦磷酸測序和甲基化特異性多重熒光PCR（MS-qPCR）兩種檢測方法分析血液DNA樣本，任一檢測產生的信號高于檢測限，既認為樣本甲基化陽性。

在Columbus隊列中，95例甲基化檢測成功，焦磷酸測序與MS-qPCR結果完全一致。有4例（4.2%）檢測到組成性MLH1甲基化，診斷時年齡分別為34、36、52和74歲，患者均首發(fā)CRC，只有一例（Columbus-65）有家族史記錄?；颊逤olumbus-6大約一半的等位基因甲基化，其他3名患者的甲基化水平較低，提示嵌合性甲基化。

兩個隊列血液樣本中檢測到的甲基化

在OCCPI隊列中，281例甲基化檢測成功，焦磷酸測序與MS-qPCR結果完全一致。有4例（1.4%）檢測到組成性MLH1甲基化，年齡分別為20、34、50和55歲，患者均首發(fā)CRC，均有不明確的家族史。3例患者約一半的等位基因甲基化，OCCPI-1血液中具有低水平（4.2%）嵌合甲基化，啟動子區(qū)c.-93G＞A雜合。取其腫瘤和配對正常結直腸粘膜（NCM）檢測，NCM檢測到類似的低水平（2.6%）嵌合MLH1甲基化，在腫瘤中檢測到高水平（60.8%）甲基化。MLH1啟動子測序顯示腫瘤中c.-93G＞A處未甲基化“A”等位基因的雜合性丟失（LOH），作為腫瘤發(fā)生的“二次打擊”。

OCCPI-1患者NCM和腫瘤檢測結果

年齡分層顯示年輕患者的組成性MLH1甲基化率高。在Columbus和OCCPI隊列中，以年齡≤55歲為界，組成性甲基化率分別為75%（3/4）和23.5%（4/17），可以檢測到大多數病例。雖然數據不全，但是4例具有BRAF V600E腫瘤檢測結果的組成性甲基化患者均為BRAF野生型。與之前的報道一致，組成性甲基化患者BRAF野生型的頻率更高。如果使用BRAF V600E檢測代替MLH1甲基化作為MLH1缺失患者的篩查，組成性MLH1甲基化患者會進一步接受MMR基因胚系檢測，并可能產生陰性/無臨床意義的檢測結果。

Columbus和OCCPI隊列中按年齡劃分的組成性MLH1甲基化檢出率

代表性研究

除了上述NCCN指南引用的隊列研究以外，之前亦有一些關于組成性MLH1表觀突變的研究或案例報道，包括原發(fā)性和繼發(fā)性表觀突變。我們從中挑選幾個代表性研究。

研究一^[6]：

法國的一項研究結合大片段PCR和高通量測序（NGS）的方法，研究了4個具有遺傳性表觀突變的家系和10例沒有證實表觀突變的患者。家系1檢出MLH1 1號外顯子3‘末端上游6 bp處AluYc序列的插入，長度為345個核苷酸。這種插入會導致MLH1基因的破壞，提供一個新的剪接供體位點，產生的轉錄本編碼截短蛋白。帶有Alu插入的等位基因在家系中與甲基化共分離。

家系1顯示組成性MLH1表觀突變的常染色體顯性遺傳，和插入AluYc序列的1號外顯子序列

家系2的先證者為CRC，一級親屬沒有癌癥病史，表現出MSI-H和PMS2孤立的蛋白表達缺失，但PMS2基因測序未發(fā)現突變。在患者腫瘤和PBL DNA中檢測到MLH1啟動子甲基化，并在6名無癥狀親屬中鑒定出表觀突變。使用多重連接探擴增（MLPA）和比較基因組雜交陣列（CGH-array）發(fā)現包含EPM2AIP1 基因和 MLH1 1-6號外顯子的大片段重復，重復片段大小約29.54 kb，片段兩端位于Alu元件中，與甲基化共分離。

家系2顯示組成性MLH1表觀突變的常染色體顯性遺傳，以及包含 EPM2AIP1 和 MLH1 1-6號外顯子的重復

在家系3中檢出MLH1 1號內含子上的新發(fā)突變c.116+106G＞A，該突變在家系中與甲基化共分離。在10例沒有證實表觀突變的患者中，有一例（P4）也是該突變的攜帶者，但其患病和未患病的家屬均未檢出表觀突變或c.116+106G＞A突變。家系4檢出MLH1 c.27G＞A同義突變，該突變在之前的結腸癌家庭登記（C-CFR）多中心研究中已有報道^[5]。在一例未證實患者（P5）中也檢出該突變，但單倍型與家系4不同。此外，研究還在一例未證實患者（P3）中檢出MLH1 5’UTR區(qū)的c.-167delA突變，與甲基化相關。

研究也證實了基因沉默先于DNA甲基化，表達程度較低的等位基因更容易甲基化的理論。有些突變本身導致等位基因完全失活，與表觀遺傳沉默無關，啟動子甲基化可能作為失活的冗余機制出現。甲基化可以作為轉錄沉默的穩(wěn)定機制，阻止細胞轉錄無功能的等位基因。此外，一些已經驗證了對剪接功能有影響的突變沒有相關的啟動子高度甲基化，這可能與序列改變影響與表觀遺傳修飾元件的結合有關。

研究二^[9]：

意大利的一項研究采用NGS和MS-MLPA等技術研究了56例患者的61個MLH1缺失腫瘤（CRC的BRAF均為野生型），有4個腫瘤樣本的甲基化水平非常高（大于0.9），4例患者的血液DNA均鑒定出組成性MLH1甲基化。

在家系F-5中，兩位成員P-09和P-10均攜帶MLH1 c.-168_c.116+713del胚系缺失，其罹患的三種腫瘤（2個CRC和1個EC）具有相同的體細胞甲基化模式。兩位患者均為組成性MLH1甲基化攜帶者，證明MLH1啟動子區(qū)的大片段缺失會導致該基因的表觀遺傳沉默，并被定義為繼發(fā)性表觀突變。

繼發(fā)性表觀突變家系F-5

在家系F-6中，P-38是一名年輕女性CRC患者，攜帶PMS2 P794S胚系臨床意義未明（VUS）突變，組織中檢測到高水平的MLH1甲基化，血液中亦檢測到甲基化。研究者將這種情況定義為MLH1原發(fā)性表觀突變。三年后，這位患者患上了MLH1缺陷的復雜子宮內膜增生。

 原發(fā)性表觀突變家系F-6和患者P-38檢測結果

指南推薦

NCCN遺傳性/家族性高風險評估：結直腸癌、子宮內膜癌、胃癌指南對于組成性MLH1表觀突變的檢測，做了如下推薦^[1]：

• 患者的組成性MLH1表觀突變是一個罕見的例外。對于早發(fā)性CRC（≤55歲）、無BRAF V600E突變、IHC中MLH1缺失、無胚系MLH1致病/疑似致病突變或任何年齡MLH1啟動子高度甲基化的>1個腫瘤患者，考慮轉診到具有基因檢測專業(yè)知識的機構進行MLH1甲基化檢測。

• 評估組成MLH1表觀突變采用血液或其他正常組織樣本檢測MLH1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。

總結

組成性MLH1甲基化是疑似LS腫瘤不可忽視的機制之一，在MLH1缺失且未發(fā)現MMR序列突變的患者中有一定的發(fā)生頻率，Columbus隊列為4.2%，OCCPI隊列為1.4%^[8]，C-CFR研究為3.8%（16/416）^[4]。但是就總體而言，組成性MLH1甲基化在未經選擇的CRC中極為罕見，Columbus隊列為0.26（4/1566），OCCPI隊列為0.12%（4/3310）^[8]，其并不影響各指南對于MLH1甲基化提示散發(fā)性腫瘤可能性較大的推薦。

對于MLH1蛋白表達缺失的CRC和EC，MLH1基因啟動子甲基化檢測有助于明確腫瘤的MMR、MSI狀態(tài)，排除林奇綜合征的風險。此外，MLH1甲基化亦可提示EC的預后，輔助治療方案的選擇^[10-11]，并且對分子分型也具有補充提示的作用^[12]。飛朔生物的MLH1基因甲基化檢測試劑盒采用MS-qPCR技術, 轉化后僅需一步操作，可檢出甲基化頻率低至1%的樣本。飛朔致力于為腫瘤個體化精準醫(yī)學檢測提供最具創(chuàng)新性的產品和服務，并持續(xù)更新現有產品。

參考文獻

[1] NCCN遺傳性/家族性高風險評估：結直腸癌、子宮內膜癌、胃癌2024 v3

[2] CSCO結直腸癌診療指南2024

[3] CSCO子宮內膜癌診療指南2024

[4] Cancer Med. 2018 Feb;7(2):433-444.

[5] Genet Med. 2013 Jan;15(1):25-35.

[6] Genet Med. 2018 Dec;20(12):1589-1599.

[7] Fam Cancer. 2016 Jul;15(3):385-93.

[8] J Natl Compr Canc Netw. 2023 Jul;21(7):743-752.e11.

[9] Genes (Basel). 2023 Nov 9;14(11):2060.

[10] J Gynecol Oncol. 2021 Nov;32(6):e79.

[11] Cancer. 2022 Mar 15;128(6):1206-1218.

[12] 中華婦產科雜志2023年10月第58卷第10期